Изменчивость ротавирусов. Кишечные заболевания.

Как показали исследования последних лет, в человеческой популяции одновременно циркулирует огромное число различных вариантов ротавирусов, что обусловлено их генетической пластичностью, изначально присущей РНК-геномным вирусам. Социркуляция ротавирусов различных штаммов и типов создает основу для формирования смешанных популяций и реассортант-ных штаммов, характеризующихся различными сочетаниями генов. Генетические вариации ротавирусов происходят двумя путями — как по линии накопления точечных мутаций, так и путем частичной замены фрагментов РНК в различных сегментах генома, т. е. делеции (Nakagomi О. et al., 1992; Tian Y. et al., 1993; Dunn S. et al., 1993; Gouvea V. et al., 1995; Palombo E. et al., 1993; Estes M., 1996). Перестановка в геноме, вероятно, обусловлена переносом (jumping) полимеразы, однако наиболее часто эти изменения идут посредством точечных мутаций. Причем, реассортация генов документирована как in vitro, так и in vivo. Следует отметить, что только одна замена в нуклеотидной последовательности способна изменить характер миграции сегмента генома, что было подтверждено при изучении штамма DS1 (G тип 2), три мутации которого привели к изменению в скорости миграции восьмого генома в ПААГ. Две мутации приводили к появлению новых вариантов гликозилирования, но не влияли на антигенность (Dunn S. et al., 1993). Возможно, что вариации форетипа в период эпидемического сезона обусловлены именно этим процессом.

Действительно, при систематическом изучении изолятов ротавирусов, проведенном в Австралии, показано, что VP7 штаммов G1 содержит 3% изменений в последовательности нуклеотидов, что в ряде случаев привело и к изменению в аминокислотной структуре (Palombo Е. et al., 1993). Другим примером являются данные, полученные при определении последовательности нуклеотидов, кодирующих VP7 у 12 ротавирусов человека первого серотипа (G1), выделенных в Японии и Китае, которые обнаружили изменения аминокислотной последовательности у всех 12 изолятов. Общая гомология была равна 92 и 96% для нуклеотидной и аминокислотной последовательностей соответственно. На основании этих данных предположительно выделены 3 подтипа: А, В и промежуточный (Xiu К. et al., 1993). Эти результаты подтверждают, что коциркуляция способствует появлению новых вариантов ротавирусов.

Позднее Gerna G. et al. (1994) были изучены два штамма: РА 169 серотипа G6 и HAL 1166 серотипа G8. Авторами показано, что у них имеется от 14 до 45% изменений в аминокислотном составе и от 22 до 43% изменений в нуклеотидной последовательности гена VP4. В реакции перекрестной нейтрализации подтверждено, что VP4 штамма РА 169 отличается от всех других ротавирусов. Гипериммунная сыворотка к реассортанту VP4 штамма РА 169 и VP7 штамма DS-1 серотипа G2 не обладала способностью нейтрализовать серотипы с ранее известными VP4. Все это указывает на то, что РА 169 представляет собой штамм с новой специфичностью VP4 (Gerna G. et al., 1994).

Выявлены также отличия у штаммов ротавирусов, циркулирующих среди разных возрастных групп населения. Изучение характеристики ротавирусов, выделенных у 60 новорожденных в Бангладеш, по данным серотипирования и электрофоретипи-рования позволило обнаружить их отличие от штаммов, циркулирующих среди всего населения. Штаммы, циркулирующие среди новорожденных, принадлежали к 4 серотипам и выявляли высокую степень гомологии по гену VP4, которой нет у штаммов, циркулирующих среди остального населения. Различие между ними заключалось в характере электрофоретической подвижности сегментов 4, 7, 8 и 9 (Shahid N. et al., 1991). Следовательно, изменчивость в структуре ротавируса носит отчетливо выраженный характер, сравнимый с таковой у вирусов гриппа.

Сегментарность генома ротавирусов приводит к возникновению реассортантов между геногруппами. Так, изучение штамма К8, выделенного от человека в Японии, показало наличие уникального нейтрализационного эпитопа на VP4. По данным РНК-РНК гибридизации этот штамм имел 4 генных сегмента, гибридизировавшихся со штаммом AU-1, и 7 сегментов (включая сегмент 4), которые гибридизировались с соответствующими сегментами гена штамма Wa.

Таким образом, было показано, что штамм К8 является межгрупповым реассортантом, образовавшимся в природе между геногруппами Wa и AU-1 (Nakagomi О. et al., 1992). Дальнейшее изучение штамма К8 путем молекулярной гибридизации и клонирования - гена VP4 в бакуловирусной системе обнаружило, что VP4 этого штамма обладает уникальной специфичностью и имеет немного эпитопов, общих с другими р-серотипами (Li В. et al., 1993).

Заслуживают также внимания результаты изучения изолятов ротавирусов, проведенное Nakagomi О., Nakagomi Т. (1991) в Японии, где для геномного анализа были выбраны 24 штамма, представляющие 22 различных форетипа. Авторы проводили гибридизацию РНК этих изолятов с мечеными 32Р зондами, приготовленными из прототипных штаммов Wa, DS-1 и AU-1, относящихся к 3 геногруппам HRV. Гибридизационный анализ показал, что каждый из изолятов обнаруживал высокую степень гомологии только с одним из трех прототипов. Однако было выявлено два изолята — AU-84 и AU-67 с необычным сочетанием серотипа (G1) первой подгруппы и короткого форетипа (II подгруппа). Анализ их геномов методом РНК-РНК гибридизации обнаружил, что их ген VP7 происходит от RV геномной группы Wa, а остальные 10 генов гибридизируются с РНК геногруппы DS-1, что доказывает наличие межгрупповой реассортации. Причем особо следует отметить тот факт, что эти штаммы, как показал эпидемиологический анализ, были выделены от двух больных, заразившихся от единого источника, что доказывает формирование реассортантов в естественных условиях.

Изменения в структуре вируса происходят и в процессе его адаптации в клеточных культурах, что было изучено на примере ротавируса свиней (штамм К), прошедшего 70 пассажей в клетках СПЭВ. Показано, что у аттенуированного штамма, утратившего вирулентность и патогенность для свиней, но сохранившего иммуногенность и антигенность, произошли изменения в вирусном белке с молекулярной массой 60 кД, которая уменьшилась до 54 кД. Эти вариации в геноме вируса, связанные с делеционной мутацией, отразились на электрофоретической мобильности сегмента 10. Причем изменений в структуре вируса до 10 пассажа выявлено не было, следовательно, они проявляются только при более длительном пассировании (Сергеев В. А. и др., 1987).

Влияние длительного пассирования в гетерогенной клеточной культуре было продемонстрировано также на примере ротавируса группы А, выделенного от ягненка (Shen S. et al., 1994, Китай). В процессе 96 пассажей вируса на клетках эмбриональной почки теленка были выявлены изменения в 5 и 6 сегментах РНК вируса. При изучении нуклеотидной и аминокислотной последовательностей в измененном фрагменте РНК показано, что в 5 сегменте имеется нормальная открытая рамка считывания, за которой располагается повтор из 473 нуклеотидов, начинающийся через 23 позиции после кодона терминации. Дуплицированная область начинается с позиции 760 и продолжается до 3' конца гена. VP6, полученный по измененному сегменту РНК, отличался нормальной длиной, однако единственная замена пролина на глютамин в положении 309 слегка изменила электрофоретическую подвижность VP6, кодируемого мутантом сегмента 6, а также снизила стабильность тримера VP6 в гене при низком pH (Shen S. et al., 1994).

Было изучено также влияние процесса адаптации ротавируса на изменения структуры сегмента VP4. Показано, что при адаптации штамма Wa ротавируса к клеткам Hep G2 выявлены изменения в нуклеотидной последовательности гена VP4, нашедшие выражение в 5 изменениях аминокислотной последовательности (Kitamoto N. et al., 1993). Следовательно, очевидным является то, что ротавирусы в процессе циркуляции или при их адаптации к новым условиям культивирования претерпевают структурные изменения. Изменения аминокислотных и нуклеотидных последовательностей влияют не только на антигенные и вирулентные потенции ротавирусов, но также и на различные стороны вирогенеза.

Исследование влияния замены аминокислотных последовательностей белков вируса на такое важное свойство, как процесс формирования вирусных частиц в культуре клеток показало, в частности, что замена аминокислот в 14 позициях со стороны N-конца VP7 приводила к быстрому транспорту последнего в аппарат Гольджи и последующей секреции в среду. Особо важную роль в отсутствии созревания VP7 в эндоплазматическом ретикулюме играют замены на участке от лейцина 7 до серина 12 (Maass Р., 1990).

Таким образом, изменчивость ротавирусов происходит как путем накопления точечных мутаций, так и заменой целых участков генома. Выделение новых штаммов с необычными свойствами показывает возможность участия их в эпидемическом процессе. В какой степени мутационные изменения и реассорта-ции дают преимущества этим штаммам в процессе циркуляции, предстоит еще выяснить.

В дополнение к вышеизложенному, исследованиями последних лет показано, что ротавирусы циркулируют в организме млекопитающих как гетерогенная популяция реассортантов и родственных вариантов. В связи с этим следует особо отметить, что для РНК-геномных вирусов характерен особый способ существования вида — «квазивид».

Благодаря чрезвычайно высокой мутабильности генетического материала, популяционные образования РНК-геномных вирусов являются «квази видами», т. е. вид представляет собой совокупность различающихся вариантов, группирующихся вокруг постоянно изменяющегося среднего значения. Этот феномен подтверждает, что генная реассортация является решающей в эволюционном механизме ротавирусов (Beards G. М., 1992; Gouvea V. et al., 1995; Kobayashi N. et al., 1995; Hoshino y! et al., 1995).